Pembahasan Protein

Praktikum ini dilakukan untuk mengetahui kandungan protein dari berbagai bahan uji yang akan dicampurkan oleh pereaksi untuk mendapatkan warna yang menentukan apakah bahan uji mengandung protein atau tidak dan apa saja protein di dalam bahan uji tersebut. Berikut bahan uji yang akan digunakan, yaitu :

a)       Putih telur

Putih telur mengandung albumin dimana bobot molekulnya sebesar 17.000-70.000. Albumin mengandung belerang, namun miskin akan residu asam amino glisin. Larutannya dalam air menggumpal apabila dipanaskan dan mengendap bila ditambah larutan ammonium sulfat jenuh. (Sumardjo, Damin. 174)

Asam amino yang larut dalam air diperoleh dari putih telur atau susu skim, berperan dalam sintesis protein dan sebagai bahan pembuat asam amino tirosin. (Kamus Gizi : Pelengkap Kesehatan Keluarga. 63)

b)      Susu

Kasein dalam susu merupakan fosfoprotein. Fosfoprotein adalah asam fosfat yang terikat dalam bentuk ester pada radikal hidroksil residu asam amino serin atau treonin, protein sederhana penyusunnya. Protein ini tidak larut dalam air tetapi larut dalam larutan basa. Larutannya dapat diendapkan dengan penambahan larutan asam encer. (Sumardjo, Damin. 176)

Asam amino yang larut dalam air diperoleh dari putih telur atau susu skim, berperan dalam sintesis protein dan sebagai bahan pembuat asam amino tirosin. (Kamus Gizi : Pelengkap Kesehatan Keluarga. 63)

Biuret

Pada uji biuret, protein yang digunakan adalah albumin, putih telur, dan susu cair. Komposisi dari reagen ini adalah senyawa kompleks yang mengandung unsur karbon (C), hidrogen (H), oksigen (O), dan Nitrogen (N) dan merupakan hasil reaksi pada suhu yang tinggi.Uji biuret dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui ada tidaknya ikatan peptida dalam suatu larutan. keenam larutan ini ketika diberi perlakuan yang sama yaitu direaksikan dengan  1ml NaOH 2,5N yang dilanjutkan dengan mereaksikannya kembali dengan beberapa tetes CuSO₄ 0,01M. Hasil yang didapatkan relative sama, yaitu larutan pada akhirnya memberikan warna ungu setelah penambahan CuSO₄

 

.

Hal tersebut dapat menandakan terbentuknya ion kompleks antara Cu²⁺ dengan gugus amino. Perubahan larutan yang terjadi  inilah yang biasanya menyatakan bahwa uji Biuret yang dilakukan pada kelima larutan protein ini bersifat uji positif. Yang memperlihatkan bahwa pada larutan putih telur, kuning telur, albumin, tirosin, dan triptofan mengandung ikatan peptida.

Xantoprotein

Uji Xantoproteat merupakan uji untuk menunjukan adanya inti benzene (cincin fenil) pada suatu sampel protein. Dalam uji Xantoproteat, inti benzene akan ternitrasi oleh asam nitrat pekat membentuk turunan nitrobenzene berwarna kuning tua. Pada suasana basa (ditambahkan larutan basa), uji Xantoproteat akan mengubah kompleks warna kuning tua pada sampel menjadi warna

orange. 

Gambar. Reaksi Uji Xantoproteat (Bintang,2010)

Dalam percobaan ini semua sampel menghasilkan uji yang positif terhadap reagen xantropoteat yang ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna kuning tua/kuning muda ketika berada dalam suasana asam (ditambahkan HNO₃) dan terbentuk kompleks berwarna jingga/kuning ketika berada dalam suasana basa (ditambahkan NaOH). (Poedjiadi 2007) Fungsi penambahan HNO₃  adalah sebagai  penyebab terjadinya reaksi nitrasi karena inti benzena dari asam amino akan  bereaksi dengan HNO₃  dan menghasilkan campuran berwarna kuning. (Girindra 1986)

Gambar. Asam Amino Mengandung Inti Benzena (Fidanci,2013)

Hasil percobaan menunjukkan, larutan protein yang menghasilkan reaksi  positif terhadap uji ini adalah  kasein 0,1%pepton 0,1% gelatin 0,1% dan fenol 0,1% Hal ini menunjukkan bahwa di dalam ketiga zat uji tersebut terdapat asam amino yang mengandung inti benzena, yaitu tirosin, fenilalanin, atau triptofan.

Hopskins-cole

Uji hopkins cole merupakan uji kimia yang digunakan untuk menunjukkan adanya asam amino triptofan. Pereaksi yang dipakai mengandung asam glioksilat. Kondensasi 2 inti induk dari trptofan oleh asam glioksilat akan menghasilkan senyawa berwarna ungu. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya cincin ungu pada bidang batas.

Triptofan merukan salah satu asam amino essensial yang tidak bisa diproduksi sendiri oleh tubuh. Gugus fungsinal triptofan adalah Indol, yang tidak dimiliki oleh asam amino lainnya membuat triptofan menjadi prekusor dari banyak senyawa penting tubuh seperti melatonin (hormon perangsang tidur), serotonin (suatu transmiter pada sistem saraf) dan niasin (suatu vitamin).

Gambar. Triptofan (Annonymous, 2012)

Gambar. Reaksi Hopkins-Cole (Annonymous, 2012)

Ketika semua bahan telah dicampur terbentuk 2 lapisan dan ada lingkaran berwarna ungu. Hal ini menunjukkan bahwa protein cair ini positif mengandung triptofan. Triptofan ini mengandung gugus indol yang akan berkondensasi dengan aldehid bila ada asam kuat yaitu H₂SO₄  sehingga terbentuk cincin berwarna ungu dibagian atas. Dalam hal ini  sebagai H₂SO₄ oksidator kuat.

Pb-asetat

Uji ini digunakan untuk menentukan adanya senyawa belerang atau sulfur pada asam amino yang berupa sistin dan metionin. Larutan yang positif mengandung gugus belerang ditandai dengan perubahan warna ataupun endapan berwarna hitam. Berdasarkan hasil percobaan di peroleh bahwa albumin terjadi reaksi positif sedangkan kasein, gliserin, tirosin dan fenol terjadi reaksi negatif. Dengan demikian albumin mengandung sistin dan mentionin yang merupakan asam amino yang mengandung gugus belerang (S). Endapan yang dihasilkan adalah PbS yang merupakan hasil reaksi antara Pb asetat dengan asam amino. Peran NaOH adalah untuk memutuskan ikatan S, sehingga S dapat berikatan dengan Pb asetat membentuk PbS atau endapan. Sedangkan Pb berperan sebagai donor untuk Pb+.

S²⁺_(aq) + Pb²⁺_(aq)  à   PbS_(s)

Pengendapan dengan logam-logam

Pada uji pengendapan dengan logam, digunakan garam logam HgCl2 dan Pbasetat, dengan protein yang sama. Penambahan garam logam berat seperti Pb-asetat dan HgCl2 akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami denaturasi. Secara bersama gugus –COOH dan gugus –NH₂ yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan membentuk senyawa kelat. Ion-ion yang dapat membentuk endapan logam dengan protein antara lain adalah Ag⁺, Ca⁺⁺, Zn⁺⁺, Hg⁺⁺, Fe⁺⁺, Cu⁺⁺, Co⁺⁺, Mn⁺⁺ dan Pb⁺⁺. Selain gugus –COOH dan gugus –NH₂, gugus –R pada molekul asam amino tertentu dapat pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. ). Jumlah endapan yang dihasilkan dipengaruhi oleh kereaktifan logam berat yang ditambahkan. Logam Hg lebih reaktif daripada Pb kerena kedua logam tersebut merupakan logam transisi pada sistem periodik unsur. Karena itu seharusnya yang terjadi pada percobaan adalah endapan pada penambahan logam Hg lebih banyak dari logam Pb. Reaksi antara logam dengan protein dapat menyebabkan terputusnya rantai samping pada protein yang menyebabkan protein menjadi tidak aktif. Selain itu, logam tersebut dapat memutuskan ikatan disulfida dan ikatan pada jembatan garam. Protein yang terdenaturasi terlihat dari endapan putih yang terbentuk.

Tes helier

Uji Heller digunakan untuk mengetahui adanya kandungan protein dalam bahan uji dengan cara mendenaturasikan menggunakan pH asam. Perubahan pH yang terjadi karena penambahan asam mineral atau penambahan basa pada protein dapat merusak ikatan garam yang terdapat pada protein tersebut. Ikatan garam dalam molekul protein adalah secara ionic dan terjadi karena gaya tarik-menarik Antara gugus –COO^- dan gugus NH₃⁺ yang berdekatan. Penambahan asam berarti penambahan ion H⁺ akan mengubah –COO^- menjadi COOH dan mengakibatkan gaya tarik-menarik hilang atau kerusakan ikatan garam dalam molekul protein. Penambahan basa yang berarti penambahan ion OH^- akan mengubah –NH₃^-  menjadi –NH₃  dan air, yang mengakibatkan hilangnya gaya tarik-menarik atau rusaknya ikatan garam pada protein tersebut. Penambahan asam atau basa pada kondisi ekstrem ke dalam larutan protein tidak hanya merusak ikatan garam tersebut, tetapi juga memutus ikatan-ikatan peptide yang terdapat dalam molekul protein. Produk denaturasi disebut protein terkoagulasi yang tidak larut dalam air tapi larut dalam larutan basa kuat dan asam kuat karena terhidrolisis menjadi bagian-bagian yang lebih sederhana. (Sumardjo, Damin. 191) Putih telur memberikan hasil positif dengan terbentuknya presipitasi putih Antara dua larutan, yaitu larutan bahan uji dan larutan HNO_3. Presipitasi ini terbentuk akibat denaturasi protein dari putih telur akibat penambahan larutan HNO₃ pekat sehingga hal ini sesuai teori bahwa putih telur mengandung protein.  

Salting out

Pada uji pengendapan dengan garam digunakan garam ammonium sulfat. Penggumpalan yang terjadi setelah penambahan garam disebabkan oleh tertariknya mantel air koloid hidrofil oleh elektrolit, peristiwa ini disebut salting out. Endapan protein tersebut diuji kelarutannya terhadap air, dan menunjukkan bahwa endapan tersebut larut dalam air. Endapan yang melarut kembali berarti albumin mengalami denaturasi dapat balik (reversible) atau redenaturasi yang hanya mengganggu ikatan struktur tertier protein pada salah satu ikatan rantai samping. Namun, endapan tersebut seharusnya tidak larut air karena salting out. Kondisi ini menyebabkan protein tidak dapat lagi melarutkan garam sehingga larutan jenuh. Uji Millon yang dilakukan terhadap endapan yang terbentuk menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya warna merah bata, yang membuktikan bahwa endapan tersebut mengandung protein. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan garam tidak merusak protein, garam hanya menutupi permukaan protein yang aktif. Pada filtrat yang menghasilkan uji positif (memberikan warna ungu) pada uji biuret menunjukkan bahwa masih terdapat protein yang belum mengendap sempurna, sehingga masih terdapat protein dalam filtrat. Seharusnya, protein dapat mengendap sempurna, sehingga memberikan uji negatif atau menghasilkan warna biru pada uji biuret.

Koagulasi

Pada uji koagulasi, protein direaksikan dengan asam asetat kemudian dipanaskan. Hasilnya, protein menggumpal atau terkoagulasi. Panas digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar pada protein sehingga protein albumin terdenaturasi dan terkoagulasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal tersebut dapat terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Penambahan asam asetat bertujuan agar larutan albumin mencapai pH isolistriknya, titik isolistrik albumin berada pada pH 4.55-4.90 (Poedjiadi 1994). Muatan gugus amino dan karboksil bebas akan saling menetralkan pada pH isolistrik sehingga molekul bermuatan nol dan mudah diendapkan (Winarno 2002). Ketika pemanasan dilakukan dan mencapai temperatur diatas 60oC kelarutan protein akan berkurang karena pada temperatur yang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau interaksi rantai samping pada struktur tertier dan kuartener yang menyebabkan koagulasi. Hasil uji koagulasi protein menunjukkan bahwa endapan tidak larut air yang berarti protein telah terdenaturasi oleh pemanasan yang dilakukan. Pada filtrat yang menghasilkan uji positif (memberikan warna ungu) pada uji biuret menunjukkan bahwa masih terdapat protein yang belum mengalami koagulasi sempurna, sehingga masih terdapat protein dalam filtrat. Seharusnya, protein dapat mengendap sempurna, sehingga memberikan uji negatif atau menghasilkan warna biru pada uji biuret.

Formol